LINEAS DE INVESTIGACION
El Laboratorio de Estructura
Molecular fue creado por el Consejo Directivo del IVIC en 1974. Inició
sus actividades científicas investigando en tres temas principales
en el campo de la Biología Estructural:
1º) Determinar
la Estructura Molecular de la Mielina con el mayor detalle espacial posible;
2º) Estudiar
la estructura y el comportamiento de fases en sistemas modelos lípido-agua
y lípido-proteína-agua;
3º) Estudiar
la Estructura y las Interacciones Moleculares entre los Componentes de
las Lipoproteínas de Plasma Humano. Más adelante, en 1984
iniciamos una nueva actividad investigativa: el estudio sobre la distribución
de la litiasis renal en nuestro país. El haber incursionado con
éxito en un problema aplicado como el de la litiasis nos motivó
a ocuparnos de otros problemas aplicados que fueran importantes para el
pais; es así como comenzamos a desarrollar técnicas para
medir parámetros estructurales en procesos mas tecnológicos
relacionados con la Química-Física de los sistemas aceite-agua,
por la relevancia que pueden tener para nuestra industria petrolera. Haber
podido trabajar en Biología Estructural en Venezuela, hace 25 años,
fué posible gracias a que en aquel momento, en el IVIC se disponía
de una serie de técnicas físicas sofisticadas tales como,
la resonancia magnética nuclear, la microscopía electrónica
y la resonancia paramagnética electrónica, así como
facilidades en sus talleres para construir los equipos de difracción
de rayos-X y de dispersión de rayos-X a ángulo bajo. Con
el transcurrir del tiempo hemos podido mejorar notablemente estas últimas
técnicas de manera original, al punto que hoy en día podemos
hacer experimentos con mucha mayor rapidez y precisión.
La determinación de
la Estructura Molecular de la Mielina es un tema importante per se por
tratarse de una membrana biológica que se encuentra naturalmente
ordenada, espiralmente enrollada alrededor de los axones en un arreglo
repetitivo de más de 100 vueltas; esa característica permite
estudiarla con técnicas cristalográficas (difracción
de rayos-X) a la resolución espacial de unos 12 Ångstroms
(un Ångstrom es la diezmillonésima parte de un milímetro).
Otra característica importante de la mielina es que es posible extraer
segmentos de nervios de animales de laboratorio en los que cada uno de
esos nervios puede contener miles de axones con mielina en su interior.
Estos nervios se conservan fisiológicamente activos aún después
de ser extraidos, por lo que los resultados estructurales obtenidos son
relevantes a una membrana biológica viva. A partir de alli, es posible
tratar los nervios para ubicarlos en distintas condiciones fisiológicas
y/o patológicas, lo que permite registrar simultaneamente los cambios
estructurales producidos por distintos estímulos fisiológicos.
Este constituye un sistema ideal para estudiar la relación estructura-función
en membranas biológicas. Son significativos los logros que hemos
obtenido en el laboratorio con el estudio básico de nervios de animales
sometidos a diversos tratamientos; desde siempre nos han interesado los
aspectos relacionados con la estabilidad de la mielina, en las posibles
causas de su pérdida y en las consecuencias patológicas que
esta conlleva. Desde hace unos 10 años, nuestros intereses en este
campo han ido evolucionando hacia el estudio de la estructura y la función
de nervios humanos en casos patológicos bien diagnosticados o en
patologías inducidas en animales de laboratorio. Esta evolución
ha tenido lugar gracias al gran avance que hemos hecho en el análisis
de los espectros de rayos-X de mielina. En efecto, este sistema de análisis,
adaptado para estudiar estructuras ordenadas unidimensionalmente, consiste
en un conjunto de algoritmos matemáticos y su software asociado,
el cual nos permite extraer, de manera rápida y precisa, un conjunto
de parámetros estructurales de ordenamiento y también del
desorden (ver detalles en logros), característicos del sistema lamelar
que se esta estudiando. Con esta tecnología en la mano, es posible
iniciar investigaciones en el campo de la neurología que afectan
al ser humano, tales como el estudio de las diversas neuropatías
humanas (en sistema nervioso central y periférico) así como
la puesta a punto de modelos animales de esas neuropatías para ensayar
el mejoramiento de terapias que puedan eventualmente ayudar a sanar más
rápidamente a las personas que padecen esas enfermedades. Otro punto
de interés en este tema es el relacionado con el desarrollo del
sistema nervioso usando las medidas de cantidad y calidad de mielina como
indicador de desarrollo. Un aspecto importante relacionado con esta idea
es el estudio de la desnutrición en la evolución del sistema
nervioso periférico y central y su posible reversión mediante
dietas apropiadas que permitan a individuos desnutridos alcanzar los niveles
de desarrollo normales de su sistema nervioso.
Mediante el estudio de la
estructura y el comportamiento de fases en sistemas lípido-agua
y lípido-proteína-agua pretendemos mimetizar algunas de las
propiedades fisiológicas de los sistemas biológicos que contienen
lípidos, tales como las membranas y las lipoproteínas de
plasma, para poder estudiarlas con mayor profundidad en esos sistemas modelos
de composición simple en donde todos los parámetros están
bien definidos. Para poder realizar esas investigaciones es necesario construir
diagramas de fase de las diversas mezclas lipídicas en una serie
de condiciones previamente establecidas, por ejemplo temperatura, concentración,
pH, etc., y determinar los dominios de existencia de las fases puras y
de las mezclas; luego hay que determinar los tipos de arreglos estructurales
de esas fases a largo rango, estableciendo si se trata de motivos que se
repiten a una, dos o tres dimensiones, con sus simetrias respectivas. También
se hace necesario cuantificar la cantidad de orden y desorden a corto rango,
ya se trate de fases del tipo llamado sméctico (con desorden en
dos dimensiones) o paracristalinas (con desorden rotacional de las moléculas).
El estudio de la Estructura
e Interacciones Moleculares entre Componentes de las Lipoproteínas
de Plasma Humano fué un tema de investigación favorito en
el laboratorio hasta el año 1984. Para comenzar, tuvimos que construir
la cámara de dispersión de rayos-X a bajo ángulo;aplicando
esa técnica estudiamos inicialmente muestras de lipoproteínas
en solución provenientes de los diversos bancos de sangre del país
y de individuos específicos, con énfasis especial en la determinación
de la estructura de las moléculas de baja (LDL) y de alta densidad
(HDL) con el objeto de establecer la ubicación, en el interior de
esas partículas, de cada una de las clases de componentes: ésteres
de colesterol, colesterol, fosfolípidos y proteínas. Luego,
gracias a una colaboración iniciada con el laboratorio de lipoproteínas
del Centro de Biofísica y Bioquímica se amplió nuestro
campo de interés hacia el estudio de la estructura de muestras de
LDL provenientes de enfermos con problemas cardiovasculares, asi como al
estudio estructural de las interacciones de las LDL con moléculas
de pared arterial y a la estabilidad de dicha interacción. Ya mas
adelante, iniciamos un proyecto que apuntaba a desarrollar un sistema para
cuantificar el porcentaje de cualquier muestra de LDL que a la temperatura
fisiológica (37 0C), se encontrase en una conformación quasi-cristalina,
la cual es mas adecuada para interaccionar con moléculas de íntima
media arterial. Esto podría permitir, tal vez, diagnosticar en un
individuo cualquiera el porcentaje de sus LDL que fuesen potencialmente
más patológicas , como una información adicional al
perfil lipídico que los pacientes se hacen de rutina.
Química-Física
de sistemas aceite-agua
La técnica que hemos
usamos para los estudios de moléculas en solución es la dispersión
de rayos-X a bajo ángulo, con la cual no solamente estamos estudiando
sistemas modelos lípido-agua de relevancia biológica, sino
que es posible usarlas para caracterizar estructuralmente algunos procesos
tecnológicos en nuestra industria petrolera y aún de la industria
farmaceútica. Mediante la técnica de dispersión de
rayos-X a bajo ángulo, cuyos aspectos teóricos conocemos
con cierta profundidad y cuyo instrumental hemos diseñado y construido
en el laboratorio, es posible determinar características tales como
la forma (laminar, cilíndrica, esférica, elipsoidal de varios
tipos, etc.) y la distribución de tamaños en muestras de
suspensiones micelares.
| Distribución
por sexo de los cálculos analizados en el laboratorio provenientes
de los diversos Estados de Venezuela |
LOGROS
La Estructura Molecular de la
Mielina. Nuestros hallazgos en este tema han sido los siguientes:
1º) Hemos encontrado
que un defecto de cationes divalentes en el medio de incubación
de los nervios, produce la desestabilización del arreglo periódico
de las membranas de mielina a nivel de la aposición de las caras
externas.
2º) Hemos encontrado
que la propagación repetida de potenciales de acción tiene
un efecto desestabilizante similar al producido por la depleción
de los cationes divalentes. Dicho efecto desestabilizador es debido primariamente
a que la mielina paranodal se hace mas laxa.
3º) Se puso
a punto un sistema experimental para estudiar nervios de ranas in vivo,
mediante el cual se determinaron los efectos de la compresión mecánica
localizada de nervios in vivo y el efecto de la inhalación de anestésicos
generales in vivo los cuales actúan engrosando las membranas.
4º) Se pusieron
a punto una serie de algoritmos matemáticos y el software asociado
para analizar espectros de difracción de rayos-X de sistemas periódicos
unidimensionales (mielina en este caso). La información producida
al final del análisis es la siguiente: D, distancia de repetición
del par de membranas que se enrollan en espiral y su varianza sD; <N>,
número de pares de membranas que rodean los axones, en promedio
en todo el nervio; amyel, porcentaje de mielinización total; aloose,
fracción de mielina que se encuentra desordenada en el paranodo
y el internodo; imotif(s), intensidad difractada por la doble membrana
y r(r), perfil de densidad electrónica, que son un par de transformadas
de Fourier recíprocas.
5º) Hemos estudiado
la cinética de desestabilización de la mielina en una serie
de condiciones fisiológicas y/o patológicas.
6º) Se estableció
el mecanismo estructural de la mielinogénesis en el sistema nervioso
central y periférico de ratas.
7º) Se pudo
determinar que los anestésicos locales actuan engrosando las membranas
de mielina y además, separándolas a nivel del espacio citoplásmatico.
8º) Se pudo
precisar que el efecto de la temperatura consiste en engrosar (baja Temperatura)
o estrechar (alta Temperatura) las membranas de mielina.
9º) El efecto
estructural y funcional de la temperatura y de los anestésicos locales
es prácticamente idéntico, lo cual nos ha permitido postular
que el fenómeno de la disminución de la actividad eléctrica
nerviosa en ambos tratamientos tiene una causa común: el engrosamiento
de la doble capa lipídica.
10º) Sueros
provenientes de ratas con Neuritis Alérgica Éxperimental
(NAE) inyectados en nervios ciáticos de ratas sanas producen desmielinización,
así hemos demostrado la transferencia pasiva de esta patología.
11º) Hemos establecido
que la desnutricion proteico calórica influye de manera importante
en el desarrollo del sistema nervioso central y periférico de ratas;
no solamente en la disminución de la cantidad de mielina que rodea
los axones, sino en que la estructura de esta es defectuosa comparada con
controles normales. En este proyecto estamos tratando de establecer condiciones
de reversibilidad que permitan que sujetos desnutridos recuperen las condiciones
estructurales y fisiológicas de los individuos nutridos normalmente.
12º) Estudiamos
unas 150 biopsias de nervios surales provenientes de otros tantos enfermos
con neuropatías periféricas. Estamos construyendo un catálogo
estructural de las diferentes patologías que llegan a la consulta
de neurología del Hospital Universitario de Caracas, con el objeto
de establecer el defecto molecular de cada una de esas enfermedades a un
nivel de confianza tal, que nos permita usar los espectros de difracción
de rayos-X con fines de diagnóstico. |
| Experimentos
de microscopia de luz y de difracción de rayos-x en nervios ciáticos
de una rata sana (columna de la izquierda) comparados con una rata a la
que se le ha inducido Neuritis Alérgica Experimental (columna de
la izquierda). Observar en las micrografias la gran cantidad de mielina
en la rata sana y la casi total ausencia de axones mielinizados en la rata
enferma. Esta disminución de la cantidad de mielina se corresponde
con la menor intensidad de los reflejos en el patrón de difracción
de rayos-x de la rata enferma. |
Estructura y
comportamiento de fases en sistemas lípido-agua y lípido-proteína-agua.
1º)
Hemos estudiado por una parte, la estructura de mezclas de fosfolípidos
y colesterol en presencia de agua y por la otra de fosfolípidos
y ergosterol. Descubrimos que a pesar de que ambos esteroles son estructuralmente
muy parecidos, hay diferencias significativas entre el comportamiento de
ambos sistemas en las fronteras de los diagramas de fase y en el dominio
de existencia de las fases puras. Estos resultados constituyen el inicio
para poder entender una serie de fenómenos fisiológicos que
ocurren en organismos inferiores como hongos y tripanosomas en presencia
de drogas capaces de destruirlos.
2º) Estudiando
en función de la temperatura, la estructura de mezclas de monoglicéridos
y agua con una serie de aditivos como colesterol y algunos fármacos
que presentan actividad anestésica, llegamos a poner en evidencia
fenómenos tales como la presencia estable de una fase con simetría
cúbica Q229, la cual nunca antes se había podido obtener
en forma estable. Lo anterior permitirá estudiarla con técnicas
de microscopía para analizarlas posteriormente mediante el estudio
computarizado de las imágenes.
3º) En los últimos
años existe un gran interés por establecer métodos
que permitan cristalizar las proteínas de membrana. Un grupo de
investigadores suizos logró recientemente cristalizar la bacteriorhodopsina
de la bacteria Halobacterium halobium en el interior de una estructura
a simetría cúbica compuesta por monooleina y agua. Este resultado
ha producido un gran revuelo en la comunidad científica internacional.
Con el fin de tratar de standarizar una método general de cristalización
de proteínas de membrana, nosotros hemos estudiado la estructura
de mezclas de monoglicéridos en presencia de agentes cristalizadores
de proteínas, para establecer el efecto estructural de esos agentes
en la forma y la simetría de las fases cúbicas. Hasta el
momento tenemos resultados que indican que es posible manejar a voluntad
el tamaño de los poros acuosos de esas fases. Este proyecto está
en pleno estudio actualmente.
| Modelo
estructural de la proteina de inclusion de virus en Bombyx mori formada
por 6 triadas de 3 sub-unidades cada una (2 laterales y 1 central) |
Estructura e
Interacciones Moleculares entre Componentes de las Lipoproteínas
de Plasma Humano.
1º) Se diseño
y construyó una cámara para dispersión de rayos-x
en bajo ángulo la cual permite estudiar partículas en solución
de tamaño hasta de 1000 Å de diámetro.
2º) Se estudiaron
muestras de LDL provenientes de personas normales y de pacientes que habían
tenido algún episodio cardiovascular reciente. Encontramos que la
estructura interna de las LDL de enfermos era mucho más ordenada
que la de los controles sanos.
3º) Demostramos
que la conformación interna de las moléculas al interior
de la LDL condiciona la estructura de la superficie y viceversa. Lanzamos
la idea de que las LDL aisladas de plasma de enfermos, cuya estructura
interna es quasi-cristalina a la temperatura fisiológica de 37 0C,
tenían modificada la estructura de su superficie, lo cual las hacía
mas afines por macromoléculas de pared arterial.
4º) Demostramos
que la LDL acomplejada con macromoléculas de pared arterial disminuye
significativamente su estabilidad estructural al punto de que en tiempos
muy cortos (minutos) la partícula expulsa las moléculas hidrofóbicas
que estan en su interior (colesterol, ésteres de colesterol y triglicéridos)
poniendolas en contacto con el medio acuoso. Lo anterior tiene como consecuencia
que debido al efecto hidrofóbico, se forme un germen de cristal
líquido con el colesterol y sus ésteres, a partir del cual
puede comenzar a crecer una placa.
5º) Demostramos
que partículas de LDL sometidas a campos magnéticos mayores
de siete (7) Tesla se orientan en ese campo produciendo espectros de difusión
de rayos-X a mayor resolución que sin orientar, lo cual implica
una mas detallada información estructural.
| Fotografía
de una muestra de arenillas renales de un paciente masculino de 40 años
y patrón de difracción de rayos-X correspondiente. La interpretación
del espectro indica que la muestra está compuesta en un 100 % por
Acido Urico monohidratado. |
Estudio sobre
la distribución de la litiasis renal en Venezuela.
1º) Hemos desarrollado
una tecnología original basada en la cristalografía de rayos-X,
que nos permite analizar cálculos renales de muy pequeño
tamaño (solamente de Un miligramo de peso) en tiempos muy cortos
(Un minuto).
2º) Nos hemos
constituido de hecho en el laboratorio nacional de análisis de cálculos
renales.
3º) Estamos
prestando un servicio al sector salud que antes no existía. Antes
de 1984 los enfermos litiásicos con posibilidades económicas
debían enviar sus cálculos a los Estados Unidos para que
fuesen analizados por cristalografia de rayos-x, pero con los métodos
convencionales que se usan en ese país, solamente es posible analizar
aquellas muestras con un peso mayor de unos 20 miligramos; esta limitación
dejaba de hecho sin posibilidad de analizar sus cálculos a aquellos
pacientes, con pequeñas piedras expulsadas o con arenillas renales,
los cuales constituyen la mayoría de la población. Esta población
y la de bajos recursos económicos debía analizar sus muestras
con métodos químicos convencionales, que han demostrado no
ser precisos. Desde 1984 todos los enfermos de cálculos renales
en Venezuela tienen acceso a nuestro servicio.
4º) Hemos organizado
una base de datos con la información socioeconómica y con
los resultados del análisis cristalográfico de unos 15.000
enfermos atendidos hasta el presente. Estos resultados, que aumentan día
a día con los análisis que seguimos efectuando, serán
publicados en el momento oportuno para uso del gremio de urólogos
y nefrólogos del país.
La
Química-Física de sistemas aceite-agua.
1º) Se han
hecho contribuciones a la caracterización de sistemas aceite-agua
de interés tecnológico, tales como: emulsiones (liposomas
y cubosomas como vehículos para drogas específicas) y mezclas
que cristalizan.
2º) Hemos contribuido
de manera fundamental a la cristalografía de los sistemas aceite-agua.
3º) Se ha contribuido
a la caracterización de materiales meso y macroporosos para la Industria.
4º) Se han caracterizado
cristalograficamente las estructuras de varias fases bicontínuas.
5º) Hemos contribuido
de manera fundamental a la caracterización estructural de catalizadores
de poro extra-ancho.
6º) Se han caracterizado
estructuralmente muestras de crudos pesados y algunos derivados en el proceso
de crackeo, provenientes de nuestra industria petrolera.
Publicaciones
selectas:
1º) Caron, F., L.
Mateu, P. Rigny and R. Azerad. Chain motions in lipid-water and protein-lipid
water phases: A spin-label and X-ray diffraction study. Journal of Molecular
Biology. 85: 279-300,1974.
2º) Stuhrmann,
H.B., A. Tardieu, L. Mateu, C. Sardet, V. Luzzati, L. Aggerbeck and A.M.
Scanu. Neutron scattering study of human serum low density lipoproteins.
Proceedings of the National Academy of Sciences (U.S.A.). 72: No. 6, 2270-2273,1975
3º) Mateu, L.,
T. Kirchhausen, R. Padrón and G. Camejo. Small-angle X-ray scattering
study of human serum low density lipoproteins with differential reactivity
for an arterial proteoglycan. Journal of Supramolecular Structure. 7:435-442,1978.
4º) Morán,
O. and L. Mateu. Loosening of paranodal myelin by the repetitive propagation
of action potentials. Nature. 304:344-345, 1983.
5º) Mateu, L.,
E.M. Avila, G. Camejo, V. León and N. Liscano. The structural stability
of low density lipoproteins: a kinetic x-ray scattering study of its interaction
with arterial proteoglycans. Biochim. et Biophys. Acta. 795:525-534,1984.
6º) Mateu, L.
La Mielina. Investigación y Ciencia, versión en castellano
de Scientific American. 131:83-93,1987.
7º) Vonasek,
E., Morán, O. and Mateu, L. An X-ray diffraction study of changes
in myelin structure during experimental allergic neuritis. J. of Neurocytol.
16:105-114,1987.
8º) Luzzati,
V. and Mateu, L. Order-Disorder phenomena in myelinated nerve sheaths.
I.- A physical model and its parametrization; exact and approximate determination
of the parameters. Journal of Molecular Biology. 215:373-384,1990.
9º) Vargas,
V., Vargas, R., Mateu, L. and Luzzati, V. The effects of malnutrition on
the physical structure of developing rat sciatic myelin. Ann. New York
Acad. Sc. 817:368-371,1997.
10º) Luzzati,
V., Mateu, L., Marquez, G. & Borgo, M. Structural and electrophysiological
effects of local anesthetics and of low temperature on myelinated nerves:
implication of lipid chains in nerve excitability. Journal of Molecular
Biology, 286:1389-1402, 1999. |
