LINEAS DE INVESTIGACION
La característica
básica de los animales es que se mueven. Este movimiento ocurre
porque los animales tienen maquinas biológicas sofisticadas denominadas
músculos las cuales son capaces de producir fuerza y trabajo, así
como movimientos a velocidades muy precisas y controladas. Los músculos
son maquinas moleculares capaces de convertir energía química
derivada de los alimentos en fuerza mecánica. El mecanismo a nivel
molecular por el cual este proceso de conversión ocurre y como se
controla precisamente es un problema importante en Biología. Nosotros
damos por sentado que los músculos de nuestros cuerpos están
contrayéndose y relajándose continuamente durante nuestra
vida diaria, y solo notamos su existencia cuando no funcionan bien. En
efecto nuestros cuerpos están formados en una gran proporción
por tejidos musculares y su movimiento coordinado es critico para nuestra
salud.
Como
todos conocemos, si un músculo es estimulado eléctricamente
se contrae y se acorta. Una pregunta que a preocupado a los científicos
por un largo tiempo es como los músculos se acortan, contraen y
producen fuerza y trabajo mecánico. Un músculo esquelético
de un vertebrado como nosotros esta hecho de muchas células denominadas
fibras las cuales son muy pequeñas, de 20 a 100 micrómetros
(un micrómetro es la millonésima parte de un metro) de diámetro.
Cada una de estas fibras musculares esta integrada por un conjunto de miofibrillas
cilíndricas de solamente 1 a 2 micrómetros de diámetro.
Dentro de cada una de estas miofibrillas hay pequeñas unidades denominadas
sarcómeros, que son las unidades básicas de producción
de fuerza similares a pequeños motores lineares, y que están
integrados por la interdigitación de dos conjuntos de filamentos,
conocidos como los filamentos gruesos, formados principalmente por la proteína
miosina; y los filamentos delgados, formados básicamente por la
proteína denominada actina. Cuando una señal transmitida
por un nervio llega a un músculo dispara su contracción y
acortamiento. Se ha descubierto que en efecto lo que ocurre es que la señal
nerviosa produce un incremento en la concentración de iones de calcio
en el interior de los sarcómeros, los cuales se acortan. La causa
del acortamiento de los sarcómeros fue descubierto simultáneamente
por Hugh Huxley y Jean Hanson, y por Andrew Huxley y Ralf Niedergerke,
quienes demostraron que lo que ocurría durante la contracción
y acortamiento era el deslizamiento de los dos conjuntos de filamentos
uno en contra del otro, denominado el modelo de los filamentos deslizantes
de la contracción.
| Portada
de la revista Journal of Structural Biology (volumen 115 numero 1, Julio-Agosto
de 1995) mostrando la reconstruccion tridimensional de filamentos gruesos
de músculo de tarántula tenidos negativamente, y substituidos
bajo congelamiento; asi como el modelo atomico preliminar de la estructura
de un filamento grueso de músculo. |
De
esta manera la pregunta macroscopica inicial de como un músculo
de contrae, se acorta y se controla se traduce a una nueva pregunta microscópica
de como la fuerza de deslizamiento entre ambos conjuntos de filamentos
se genera y se controla. Para responder esta nueva pregunta es preciso
ir un paso mas en el interior de la maquina muscular denominada sarcómero.
Hugh Huxley descubrió que los filamentos gruesos están formados
principalmente por una molécula de proteína denominada miosina.
Cada molécula de miosina tiene una cola o bastón muy largo
en un extremo y dos cabezas globulares en el otro extremo. Las colas o
bastones se empacan entre si formando el núcleo o esqueleto del
filamento, y las cabezas de miosina sobresalen en su superficie. El deslizamiento
de los filamentos gruesos y delgados uno contra del otro ocurre cuando
las cabezas de miosina se enlazan a las moléculas globulares de
actina que forman los filamentos delgados, formando lo que Hugh Huxley
denomino puentes cruzados, proceso este que ocurre de manera cíclica.
Huxley denomino este proceso cíclico el ciclo de los puentes cruzados
como una explicación de como un sarcómero se acortaba durante
la contracción muscular: muchas cabezas de miosina de los filamentos
gruesos se mueven fuera de la superficie y se enlazan a las moléculas
adyacentes de actina en los filamentos delgados, cada una de ellas cambia
de conformación y arrastra a los filamentos delgados produciendo
el deslizamiento y acortamiento del sarcómero. Cada cabeza es un
motor molecular independiente capaz de producir fuerza y deslizarse independientemente
de los otros. De nuevo la pregunta incial que hicimos antes, primero a
un nivel macroscópico, y luego a un nivel microscópico; la
podemos ahora hacer a un nivel molecular: como estos motores moleculares,
o cabezas de miosina, pueden producir fuerza y como esta se controla? Fue
el descubrimiento de la estructura cristalográfica de la cabeza
de miosina la que abrió las puertas para poder responder esta nueva
pregunta.
Nosotros
estamos tratando de comprender como se controla la contracción muscular
al incrementarse la concentración de calcio. Específicamente
estamos interesados en comprender por que en algunos músculos un
incremento en la concentración de calcio libera las cabezas de miosina
de la superficie del filamento, activándolos para estar listos para
interaccionar con la actina para producir fuerza durante el ciclo de los
puentes cruzados. Cada cabeza de miosina esta formada por tres cadenas
polipeptídicas: una cadena pesada que forma la mayor parte de la
cabeza globular, y dos cadenas ligeras, denominadas las cadenas ligeras
esenciales y reguladora. Nosotros estamos estudiando un tipo particular
de músculo estriado de las extremidades de las tarántulas
en los cuales los cationes calcio se pueden acomplejar con el polipeptido
calmodulina, el cual a su vez se acompleja con una quinasa especifica (conocida
como la quinasa de la cadena ligera de la miosina QCLM) la cual puede fosforilar
un aminoácido especifico de la cadena ligera reguladora (CLR) de
la cabeza de miosina añadiéndole cargas negativas a ella.
En estos músculos cuando la concentración de calcio es baja
las cabezas de miosina están localizadas yaciendo sobre la superficie
de los filamentos gruesos, formando hélices.
| Portada
de la revista Journal of Molecular Biology (volumen 275 numero 1, Enero
1998) mostrando el ajuste de las coordenadas atómicas de la molécula
de miosina a la reconstrucción tridimensional de filamentos gruesos
de músculo. |
Nuestros
estudios en comprender las bases moleculares de la activación de
las cabezas de miosina de los filamentos gruesos puede ser de alguna importancia
en vista de los recientes estudios hechos por la Dr. Rhea Levine y sus
colegas (Department of Neurobiology and Anatomy, Allegheny University of
Health Sciences, Philadelphia) sobre la enfermedad hereditaria denominada
Cardiopatia Hipertrofica Familiar (CHF). Ellos estudiaron el efecto de
una CLR mutante en la estructura y función del músculo esquelético
lento deltoides obtenido de muestras de biopsias que expresaban al aminoácido
lisina en lugar del aminoácido glutamato en el residuo #22 de la
CLR de pacientes con CHF heredada, caracterizada por un engrosamiento anormal
del músculo papilar del ventrículo izquierdo así como
de la pared del ventrículo izquierdo y el septum ventricular. Sus
resultados indican que la respuesta de los filamentos gruesos de pacientes
con CHF es mas sensible a calcio y que sus cabezas de miosina están
completamente desordenadas en la superficie de los filamentos gruesos.
Por tanto la comprensión de las bases de como las hélices
de las cabezas de miosina se forman y se mantienen, así como la
manera como las cabezas de miosina se liberan y se desordenan pudiera ser
de interes para comprender mas sobre esta y otras enfermedades musculares.
Nosotros
estamos interesados en comprender las bases moleculares de como esta modulación
ocurre, en otras palabras cuales son las razones por las cuales las cabezas
de miosina se mantienen yaciendo sobre la superficie de los filamentos
gruesos formando helices en condiciones de relajación, en presencia
de ATP; y además porque la fosforilación de un aminoácido
serina de la CLR ubicado cercano al cuello de la cabezas de miosina, induce
la disrupción del arreglo en hélice y la liberación
de las cabezas retenidas en la superficie del filamento.
El
objetivo final de nuestra investigación es comprender los detalles
del mecanismo molecular de como las cabezas de miosina forman hélices
y como estas se desordenan cuando el músculo se activa debido a
la fosforilación. Nuestros pasos futuros incluyen utilizar la crio-Microscopía
Electrónica para examinar los filamentos gruesos para permitirnos
obtener una resolución mayor que la anteriormente obtenida por tinción
negativa. Luego estaremos en posición de determinar modelos atómicos
mas confiables que podremos refinar contra los patrones de difracción
de rayos-X obtenidos de músculo vivo. |
LOGROS
Nosotros hemos encontrado que
cuando los músculos están en estado de reposo las cabezas
de miosina se mantienen cercanas a la superficie del filamento grueso formando
hélices, y que para que las hélices se formen se requiere
la presencia de adenosintrifosfato (ATP). Nosotros hemos observado directamente
filamentos gruesos aislados de músculo relajado usando el microscopio
electrónico. De las micrografías Electrónicas hemos
calculado una reconstrucción tridimensional que muestra la estructura
de las cabezas de miosina en la superficie de los filamentos gruesos. Nosotros
hemos posicionado visualmente la estructura atómica de la molécula
de la cabeza de miosina sobre esta reconstrucción tridimensional
obteniendo un modelo atómico preliminar del filamento grueso. Mas
recientemente hemos desarrollado en colaboración con el Dr. Gerald
Offer de Bristol University un procedimiento automático de ajuste
tridimensional computarizado que nos permite construir modelos atómicos
de los filamentos gruesos y determinar cual es el mejor posible modelo
atómico
Nosotros también
hemos encontrado que cuando se incrementa la concentración de los
iones calcio, se produce la fosforilación de las CLR de la miosina,
y que las cabezas de miosina se separan de la superficie del filamento
grueso, desordenándose completamente, según se detecta por
Microscopía Electrónica y por difracción de rayos-X.
| Diagrama
de modelo de filamento grueso de músculo propuesto por nosotros
mostrando la disposición antiparalela de cabezas de miosina. (ver
Darnell, Lodish y Baltimore: Molecular Cell Biology, Scientific American
Books 1990). |
Nosotros
pensamos que en estos músculos esta fosforilación es una
manera de modular el numero de cabezas de miosina que pueden ser activadas
y estar listas para contracción. Cuando la concentración
de calcio es baja, las cadenas ligeras reguladoras no están fosforiladas
y los músculos están en estado relajado, en el que las cabezas
de miosina se mantienen yaciendo sobre la superficie del filamento grueso
formando hélices, en otras palabras una fracción de las cabezas
de miosina no están disponibles (están "atrapadas") para
interaccionar fácilmente con las moléculas de actina y solo
el resto de ellas puede involucrarse rápidamente en el ciclo de
los puentes cruzados. Por otra parte, cuando se incrementa la concentración
de calcio, la calmodulina y la QCLM fosforila un cierto numero de cabezas
de miosina, que son entonces "reclutadas" o liberadas de la superficie
del filamento grueso, permitiendo que un numero mayor de cabezas de miosina
este disponible para la producción de fuerza, permitiendo una modulación
de la fuerza total producida por el músculo.
Nuestros
logros científicos se pueden resumir en:
1.-
Visualización de filamentos gruesos de músculo estriado en
estado congelado-hidratado en el crio-microscopio electrónico.
2.-
Desarrollo de un método computarizado para el ajuste de las coordenadas
atómicas de la molécula de miosina a las densidades del mapa
tridimensional del filamento grueso de músculo estriado. Refinación
de dicho modelo contra del patrón de difracción de rayos-X
correspondiente.
3.-
Determinación del modelo atómico de los filamentos gruesos
de músculo estriado mediante el ajuste visual de las coordenadas
atómicas de cabezas la molécula de miosina a la envolvente
del mapa tridimensional de filamentos gruesos obtenido por Microscopía
Electrónica.
4.-
Desarrollo de una técnica de enfriamiento rápido que permite
congelar músculos vivos en plena contracción en menos de
2 milisegundos, en instantes predeterminados del twitch o tétano.
Dicha técnica puede ser utilizada además con músculos
desmembranados y en contracción inducida por difusión de
Ca++.
5.-
Demostración por vez primera de que con dicha técnica es
posible preservar la estructura en hélice de los filamentos gruesos
en músculos vivos o desmembranados en estado relajado.
6.-
Determinación de la reconstrucción tridimensional de filamentos
gruesos preservados con dicha técnica.
7.-
Determinación directa de la simetría rotacional de filamentos
gruesos de músculo de artrópodo preservados con dicha técnica.
8.-
Establecer con dicha técnica la existencia de cambios estructurales
en las cabezas de miosina que están situadas en la zona-H entre
músculo relajado y en rigor.
9.-
Establecer por Microscopía Electrónica que al fosforilar
la cadenas ligeras regulatorias de las cabezas de miosina de músculo
de tarántula, estas se despegan del esqueleto del filamento y se
desordenan o se mueven hacia afuera, en preparación para la contracción.
10.-
Establecer por difracción de rayos-X que dicho cambio ocurre por
un movimiento de las cabezas de miosina 6 nm hacia afuera del esqueleto.
11.-
Desarrollar un método rápido de purificación de miosina
de artrópodo.
12.-
Establecer la subestructura del esqueleto del filamento grueso de invertebrados.
13.-
Establecer la simetría rotacional de filamentos gruesos de bivalvo
de manera directa por enfriamiento rápido.
14.-
Desarrollo de un método de substitución bajo congelamiento
para tejido muscular preservado por enfriamiento rápido.
15.-
Establecer mediante microscopía electrónica y análisis
y reconstrucción tridimensional de imágenes el arreglo y
la orientación espacial de ambas cabezas de cada molécula
de miosina de los filamentos gruesos de músculo en el estado relajado,
lo cual ha permitido postular la explicación del proceso de activación
de los filamentos gruesos basada en la fosforilación de las cadenas
ligeras regulatorias de las cabezas de miosina: en el estado relajado ocurre
una interacción entre cabezas de miosina axialmente contiguas, que
mantiene al arreglo de puentes de miosina ordenadamente pegado al esqueleto
del filamento - como un cierre de cremallera - evitando su interacción
con las moléculas de actina vecinas; al ser fosforiladas las cadenas
ligeras regulatorias la interacción entre moléculas de miosina
desaparece, por lo cual las cabezas de miosina se despegan del esqueleto
del filamento, listas para interactuar con las moléculas de actina
produciendo la contracción muscular.
16.-
Establecer por difracción de rayos-x que la orientacion del eje
largo de la molecula asimetrica de actina esta orientado perpendicularmente
al eje del filamento, lo cual tiene implicaciones en el mecanismo molecular
de la contraccion muscular, a nivel de la interfase miosina-actina.
17.-
Establecer por difracción de rayos-x la estructura de un estado
intermedio del ciclo de los puentes de miosina de la contraccion muscular,
específicamente que solo el dominio de la cola de la cabeza de la
molécula de miosina sufre cambios conformacionales entre el estado
inicial de enlace a actina y el final del golpe de potencia, mientras que
el dominio cercano a la actina no sufre cambios. Esta información
permite discriminar entre diversos modelos de contracción muscular,
ya que circunscribe los cambios estructurales a una región intra-dominio
de la cabeza de miosina
| Modelo
atómico de filamento grueso de músculo. |
Publicaciones
selectas:
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